APOBEC3A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418267-ACT

Humanes APOBEC3A kodiert eine zinkabhängige Cytidin-Deaminase aus der APOBEC-Familie, die C‑zu‑U-Editierung an einzelsträngiger DNA katalysiert und unter Replikationsstress die Genomstabilität beeinflussen kann. Es ist an der angeborenen antiviralen Abwehr beteiligt und greift in Prozesse der DNA-Schadensantwort und -Reparatur ein, einschließlich Signalwegen, die mit der Verarbeitung von Replikationsgabeln und Mutagenese verknüpft sind. Eine dysregulierte APOBEC3A-Aktivität wird mit charakteristischen Mutationssignaturen durch Cytidin-Deaminierung in zahlreichen Krebsarten sowie mit entzündlichen Kontexten in Verbindung gebracht, die ssDNA-Substrate erhöhen. Daher wird APOBEC3A umfassend hinsichtlich seiner Rollen in Wirt–Pathogen-Interaktionen, der Restriktion endogener Retroelemente und der Mechanismen untersucht, die somatische Mutationslandschaften prägen.

APOBEC3A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen APOBEC3A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

APOBEC3A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des APOBEC3A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der APOBEC3A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen APOBEC3A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native APOBEC3A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von APOBEC3A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des APOBEC3A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem APOBEC3A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.