ANT2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400680-ACT

SLC25A5 codifica a translocase de nucleótidos de adenina 2 (ANT2), um transportador da membrana interna mitocondrial que troca ADP citosólico por ATP da matriz, acoplando a fosforilação oxidativa à procura energética celular. Ao regular o fluxo de nucleótidos de adenina e o potencial de membrana mitocondrial, a ANT2 influencia a homeostase bioenergética, o equilíbrio redox e a suscetibilidade a respostas ao stress associadas à transição de permeabilidade mitocondrial. A atividade da ANT2 está ligada à reprogramação metabólica e a estados proliferativos, e a expressão alterada tem sido estudada no contexto do metabolismo tumoral e de outras perturbações com disfunção mitocondrial. Como transportador de solutos ligado ao X, o SLC25A5 também é relevante para investigações sobre a utilização de energia específica de tecido e sobre a sinalização compensatória entre isoformas de ANT.

ANT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC25A5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ANT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC25A5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC25A5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ANT2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC25A5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ANT2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ANT2 em células tumorais com expressão de SLC25A5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.