ANO4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406887-ACT

Humanes ANO4 (Anoctamin 4) kodiert ein Mitglied der TMEM16-/Anoctamin-Familie von Multipass-Membranproteinen, die mit dem Anionen- und Phospholipidtransport an zellulären Membranen in Verbindung gebracht werden. Die ANO4-Aktivität wurde mit Ca2+-reguliertem Membranumbau verknüpft, einschließlich Prozessen wie dem Phospholipid-Scrambling, das den Vesikeltransport, die Zellsignalisierung und Stressantworten beeinflussen kann. Über diese Funktionen ist ANO4 an Signalwegen beteiligt, die die intrazelluläre Kalziumdynamik mit Veränderungen der Membranzusammensetzung und Erregbarkeit koppeln. Eine veränderte Funktion der TMEM16-Familie, einschließlich ANO4, ist von Interesse für Studien zu neurologischen Phänotypen, zur Biologie von Thrombozyten und Immunzellen sowie zu krebsassoziierten Anpassungen der membranbasierten Signalübertragung.

ANO4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ANO4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANO4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ANO4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ANO4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANO4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ANO4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANO4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANO4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ANO4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.