ANKH CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419107-ACT

Mouse Ank kodiert ANKH, einen multipassigen Membrantransporter, der den Export von anorganischem Pyrophosphat (PPi) und die Homöostase der extrazellulären Mineralisierung reguliert. Durch die Steuerung der PPi-Verfügbarkeit beeinflusst ANKH die Hydroxylapatitablagerung, osteogene Differenzierungsprogramme sowie das umfassendere Phosphat-/Pyrophosphat-Gleichgewicht in Skelett- und Gelenkgeweben. Eine veränderte ANKH-Aktivität ist mit aberranten Verkalkungsphänotypen und Gelenkpathologie verknüpft und stellt damit einen hilfreichen Ansatzpunkt zur Untersuchung der Knorpelbiologie, des Knochenumbaus und verkalkungsassoziierter entzündlicher Prozesse dar. Dieses Gen wird häufig in Modellen der ektopen Mineralisierung und zur Aufklärung von Mechanismen degenerativer Gelenkerkrankungen untersucht.

ANKH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ank-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANKH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ank-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ank-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANKH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ank-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANKH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANKH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ank-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.