ANKFY1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406658-ACT

Das humane ANKFY1 (ankyrin repeat and FYVE domain containing 1) kodiert einen membranassoziierten Adapter, der über die Interaktion seiner FYVE-Domäne mit Phosphatidylinositol-3-phosphat am endosomalen Transport sowie an der Rab5-abhängigen Dynamik früher Endosomen beteiligt ist. Durch die Koordination von Fracht-Sortierung, Rezeptor-Recycling und Endosomenreifung trägt ANKFY1 zu regulierten Signaloutputs internalisierter Rezeptoren bei und kann zelluläre Homöostasewege beeinflussen, die mit Wachstumsfaktor- und Nährstoffsensorik verknüpft sind. Ein dysregulierter endozytischer Transport ist ein wiederkehrendes Merkmal in der Krebsbiologie und bei neurodegenerativen Erkrankungen, wodurch ANKFY1 einen relevanten Knotenpunkt für mechanistische Studien zu vesikelvermittelter Signalgebung und Proteostase darstellt. Seine Domänenarchitektur eignet sich zudem zur Untersuchung der Phosphoinositid-Bindung, ankyrinrepeat-vermittelter Proteininteraktionen und der kompartimentspezifischen Regulation von Transportkomplexen.

ANKFY1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ANKFY1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANKFY1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ANKFY1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ANKFY1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANKFY1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ANKFY1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANKFY1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANKFY1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ANKFY1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.