AMPKβ2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403537-ACT

PRKAB2 codifica la subunità regolatoria umana AMPKβ2 della chinasi proteica attivata da AMP (AMPK), un sensore energetico centrale che integra la disponibilità di nutrienti con il metabolismo cellulare. AMPKβ2 sostiene l’assemblaggio e la stabilità del complesso AMPK eterotrimerico e contribuisce al legame con il glicogeno, consentendo un controllo coordinato dell’assorbimento di glucosio, della glicolisi, dell’ossidazione degli acidi grassi e della biogenesi mitocondriale. Attraverso una segnalazione dipendente dalla fosforilazione, AMPK interagisce con le vie di mTOR, dell’autofagia e dell’insulina/IGF per regolare la crescita, l’adattamento allo stress e l’omeostasi bioenergetica. Una segnalazione AMPK deregolata e un’espressione alterata di PRKAB2 sono state associate a squilibri metabolici e a programmi di stress cellulare rilevanti per la ricerca su obesità, diabete di tipo 2 e metabolismo tumorale.

AMPKβ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKAB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AMPKβ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKAB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKAB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AMPKβ2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKAB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AMPKβ2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AMPKβ2 nelle cellule tumorali con espressione di PRKAB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.