AMPKβ2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403537-ACT

PRKAB2 kodiert die menschliche regulatorische AMPKβ2‑Untereinheit der AMP‑aktivierten Proteinkinase (AMPK), eines zentralen Energiesensors, der die Nährstoffverfügbarkeit mit dem zellulären Stoffwechsel verknüpft. AMPKβ2 unterstützt den Zusammenbau und die Stabilität des heterotrimeren AMPK‑Komplexes und trägt zur Glykogenbindung bei, wodurch eine koordinierte Kontrolle von Glukoseaufnahme, Glykolyse, Fettsäureoxidation und mitochondrialer Biogenese ermöglicht wird. Über phosphorylierungsabhängige Signalübertragung steht AMPK in Wechselwirkung mit mTOR‑, Autophagie‑ sowie Insulin/IGF‑Signalwegen und reguliert so Wachstum, Stressanpassung und die bioenergetische Homöostase. Eine fehlregulierte AMPK‑Signalgebung und veränderte PRKAB2‑Expression wurden mit metabolischer Dysbalance und zellulären Stressprogrammen in Zusammenhang gebracht, die für die Forschung zu Adipositas, Typ‑2‑Diabetes und Krebsstoffwechsel relevant sind.

AMPKβ2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKAB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMPKβ2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKAB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKAB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMPKβ2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKAB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMPKβ2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMPKβ2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKAB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.