AMPKβ1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402952-ACT

PRKAB1 kodiert die regulatorische β1-Untereinheit der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), eines zentralen zellulären Energiesensors, der als Reaktion auf Nährstoff- und Stresssignale die metabolische Homöostase koordiniert. AMPKβ1 unterstützt die Assemblierung und Stabilität des AMPK-Heterotrimers und trägt zur Substratadressierung sowie zur subzellulären Lokalisation bei. Dadurch beeinflusst es Phosphorylierungsprogramme, die Glukoseaufnahme, Fettsäureoxidation, mitochondriale Biogenese, Autophagie und die mTORC1-Signalübertragung steuern. Über diese Signalwege wirkt AMPKβ1 auf Entscheidungen zum Zellwachstum, das Redoxgleichgewicht sowie die Anpassung an Hypoxie und energetischen Stress ein. Eine Fehlregulation der AMPK-Signalgebung wird mit Stoffwechselerkrankungen, Entzündungen und krebsrelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht, was PRKAB1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien energieabhängiger Signalnetzwerke macht.

AMPKβ1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKAB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMPKβ1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKAB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKAB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMPKβ1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKAB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMPKβ1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMPKβ1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKAB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.