Amphiphysin II CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401263-ACT

BIN1 kodiert Amphiphysin II, ein BAR-Domänen-haltiges Protein der Membranremodellierung, das die clathrinvermittelte Endozytose, die Biogenese der T-Tubuli und krümmungsabhängige Transportprozesse durch Interaktionen mit Dynamin und phosphoinositidreichen Membranen koordiniert. Amphiphysin II unterstützt die Vesikelbildung und die Organisation des Zytoskeletts und übernimmt kontextabhängige Funktionen in der neuronalen synaptischen Aktivität sowie in der Membranarchitektur von Muskelzellen. Veränderte BIN1-Expression und alternatives Spleißen wurden mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die für die myotubuläre Myopathie und neuromuskuläre Degeneration relevant sind; zudem wird BIN1 im Zusammenhang mit Veränderungen endozytotischer Netzwerke untersucht, wie sie in der Biologie neurodegenerativer Erkrankungen beobachtet werden. Diese Funktionen machen BIN1 zu einem nützlichen Ziel, um Membrandynamik, transportabhängige Signalgebung und zelltypspezifische Isoformregulation in humanen Modellsystemen zu analysieren.

Amphiphysin II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BIN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Amphiphysin II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BIN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BIN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Amphiphysin II-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BIN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Amphiphysin II-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Amphiphysin II-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BIN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.