Aminoacylase-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408464-ACT

ACY1 kodiert für Aminoacylase-1, eine zinkabhängige, zytosolische Hydrolase, die die Deacylierung von N-acyl-L-Aminosäuren katalysiert und dadurch freie Aminosäuren und Acetat erzeugt. Diese Aktivität unterstützt das „Salvage“ von Aminosäuren sowie den Stickstoffstoffwechsel und kann intrazelluläre Substratpools beeinflussen, die Schnittstellen zu umfassenderen Stoffwechsel- und Proteostase-Wegen aufweisen. Aminoacylase-1 ist außerdem an der Verarbeitung acetylierter Aminosäurederivate beteiligt, die beim Peptidabbau entstehen, wodurch seine Funktion mit der zellulären Homöostase unter metabolischem Stress verknüpft ist. Eine veränderte ACY1-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, darunter krebsassoziierte metabolische Reprogrammierung und angeborene Störungen des Aminosäurestoffwechsels, was ACY1 zu einem nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Studien macht.

Aminoacylase-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACY1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Aminoacylase-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACY1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACY1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Aminoacylase-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACY1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Aminoacylase-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Aminoacylase-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACY1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.