alpha-L-iduronidase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403722-ACT

IDUA codifica a alfa-L-iduronidase, uma hidrolase lisossomal necessária para a degradação passo a passo dos glicosaminoglicanos sulfato de heparano e sulfato de dermatano. Ao sustentar o catabolismo lisossomal e as vias celulares de depuração, IDUA contribui para a renovação de proteoglicanos e para a homeostase global dos lisossomos. A redução da atividade de IDUA está associada ao acúmulo de glicosaminoglicanos e a respostas de estresse celular subsequentes, comumente estudadas no contexto da biologia de doenças de armazenamento lisossomal. Assim, IDUA é frequentemente utilizada como uma ferramenta molecular para investigar metabolismo dependente de lisossomos, tráfego intracelular e reciclagem de macromoléculas em sistemas celulares humanos.

alpha-L-iduronidase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IDUA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

alpha-L-iduronidase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IDUA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IDUA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de alpha-L-iduronidase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IDUA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de alpha-L-iduronidase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via alpha-L-iduronidase em células tumorais com expressão de IDUA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.