ALP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401877-ACT

PDLIM3 kodiert ALP (Actinin-assoziiertes LIM-Protein), ein Gerüstprotein (Scaffold) der PDZ-LIM-Familie, das in quergestreifter Muskulatur an der Z-Scheibe lokalisiert und die Organisation des Zytoskeletts mit Signalprozessen koppelt. Durch die Bindung an α-Actinin- und aktinassoziierte Komplexe trägt ALP dazu bei, den Aufbau des Sarkomers, die Mechanotransduktion sowie Programme der Proteinkontrolle (Protein-Quality-Control) zu koordinieren, die die Integrität der Myofibrillen aufrechterhalten. Störungen in PDLIM3-assoziierten Netzwerken wurden mit veränderter Struktur und Funktion von Herz- und Skelettmuskel in Verbindung gebracht, was Untersuchungen in Signalwegen nahelegt, die für Kardiomyopathien und Myopathien relevant sind. In Zell- und Gewebemodellen wird die Modulation der ALP-Expression häufig genutzt, um Stressantworten, zytoskelettales Remodeling und Differenzierungszustände von Muskelzellen zu untersuchen.

ALP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDLIM3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDLIM3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDLIM3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDLIM3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDLIM3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.