ALKBH5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-435243-ACT

Das murine Gen *Alkbh5* kodiert ALKBH5, eine Fe(II)/α‑Ketoglutarat‑abhängige RNA‑Demethylase, die N6‑Methyladenosin-(m6A)-Markierungen entfernt und dadurch RNA‑Stabilität, Spleißen, nukleären Export und Translation reguliert. Durch die Gestaltung epitranskriptomischer Zustände beeinflusst ALKBH5 Genexpressionsprogramme, die Zellproliferation, Differenzierung, Stressantworten und Entwicklungsprozesse steuern. Die Aktivität von ALKBH5 greift in m6A‑„Writer“- und „Reader“-Signalwege ein, um das Schicksal von Transkripten im Zellkern und im Zytoplasma zu modulieren. Eine fehlregulierte m6A‑Dynamik unter Beteiligung von ALKBH5 wurde in der Literatur mit veränderten Zellzustandsübergängen und krankheitsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz in mechanistischen Studien des RNA‑Metabolismus stützt.

ALKBH5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Alkbh5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALKBH5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Alkbh5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Alkbh5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALKBH5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Alkbh5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALKBH5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALKBH5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Alkbh5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.