Plasmide CRISPR d'Activation (h) ALKBH3: sc-406896-ACT

ALKBH3 (également connu sous le nom d’ABH3) code une dioxygénase dépendante du Fe(II)/2‑oxoglutarate qui déméthyle des acides nucléiques alkylés, notamment des lésions telles que la 1‑méthyladénine et la 3‑méthylcytosine dans l’ADN simple brin et l’ARN. En inversant les dommages cytotoxiques dus à l’alkylation, ALKBH3 contribue au maintien du génome, à la tolérance au stress de réplication et au métabolisme de l’ARN en conditions génotoxiques. Son activité s’articule avec les voies de réponse aux dommages de l’ADN et peut influencer des programmes transcriptionnels liés à la progression du cycle cellulaire. Une expression altérée d’ALKBH3 a été rapportée dans plusieurs contextes tumoraux et fait l’objet d’études portant sur son lien avec des phénotypes d’instabilité génomique et la sensibilité cellulaire au stress alkylant dans des systèmes modèles.

ALKBH3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALKBH3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ALKBH3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALKBH3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALKBH3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ALKBH3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALKBH3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ALKBH3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ALKBH3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ALKBH3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.