Plasmide CRISPR d'Activation (h) ALK: sc-400460-ACT

ALK (anaplastic lymphoma kinase) code une tyrosine kinase réceptrice de la superfamille des récepteurs de l’insuline, qui régule la croissance et la survie cellulaires ainsi que le développement neuronal. Après une activation dépendante du ligand et une autophosphorylation, ALK propage la signalisation via les voies MAPK/ERK, PI3K–AKT et JAK/STAT, influençant des programmes transcriptionnels et la dynamique du cytosquelette. En biologie des maladies humaines, une activation aberrante d’ALK par des fusions géniques, une amplification ou des mutations ponctuelles activatrices est associée à des réseaux de signalisation oncogéniques et à des états de différenciation modifiés. Ces propriétés font d’ALK un nœud largement utilisé pour étudier l’architecture des voies des tyrosine kinases réceptrices, les boucles de rétrocontrôle de la transduction du signal et les réponses transcriptionnelles dépendantes du contexte.

ALK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ALK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ALK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ALK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ALK dans les cellules tumorales présentant une expression de ALK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.