Aldose Reductase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401437-ACT

AKR1B1 kodiert die humane Aldosereduktase, eine NADPH-abhängige Oxidoreduktase, die die Reduktion von Glukose und anderen Aldehyden zu den entsprechenden Alkoholen katalysiert. Sie stellt einen wichtigen Eintrittspunkt in den Polyolweg dar, beeinflusst über den Verbrauch von NADPH das intrazelluläre Redoxgleichgewicht und trägt zu osmotischen sowie oxidativen Stressantworten bei. Die Aldosereduktase ist zudem an der Entgiftung reaktiver Carbonylspezies und von Aldehyden beteiligt, die bei der Lipidperoxidation entstehen, wodurch die AKR1B1-Aktivität mit zellulärer Stresssignalgebung und entzündlichen Prozessen verknüpft ist. Eine dysregulierte AKR1B1-Expression oder -Aktivität wurde mit Phänotypen metabolischen Stresses und Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes in Verbindung gebracht, ebenso wie mit breiteren Kontexten oxidativer Schädigung und Gewebeverletzung.

Aldose Reductase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AKR1B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Aldose Reductase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AKR1B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AKR1B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Aldose Reductase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AKR1B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Aldose Reductase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Aldose Reductase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AKR1B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.