Aldolase C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400988-ACT

ALDOC kodiert Aldolase C, ein glykolytisches Enzym, das die reversible Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat katalysiert und damit den Glukosestoffwechsel mit der ATP-Produktion und biosynthetischen Stoffflüssen verknüpft. In menschlichen Geweben ist ALDOC stark mit neuronalen und astrozytären Stoffwechselprogrammen assoziiert und trägt zur Kopplung der Glykolyse an das zelluläre Redoxgleichgewicht und an Stressantworten bei. Eine veränderte ALDOC-Expression wurde im Zusammenhang mit Neurodegeneration, ischämischen Schäden und Tumormetabolismus beschrieben, was seine Nutzung als Marker und als mechanistischer Knotenpunkt bei metabolischer Umprogrammierung stützt. Als zentraler Bestandteil des Kohlenhydratstoffwechsels bietet Aldolase C einen Ansatzpunkt, um die Kontrolle der Glykolyse, die Energiehomöostase und den metabolischen Austausch mit mitochondrialen Signalwegen zu untersuchen.

Aldolase C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALDOC-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Aldolase C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALDOC-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALDOC-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Aldolase C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALDOC-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Aldolase C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Aldolase C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALDOC-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.