ALAS-H Plasmide KO CRISPR/Cas9 (h): sc-406443

Panoramica

ALAS1 umano codifica la 5-aminolevulinato sintasi “housekeeping” (ALAS-H), un enzima mitocondriale dipendente dal fosfato di piridossale che catalizza la prima tappa, limitante la velocità, della biosintesi dell’eme a partire da glicina e succinil-CoA. Controllando la produzione di 5-aminolevulinato, ALAS-H collega la disponibilità cellulare di eme al metabolismo ossidativo, alla funzione dei citocromi e della catena respiratoria e, più in generale, ai processi dipendenti dalle tetrapirroli. L’espressione di ALAS1 è strettamente integrata con la biogenesi mitocondriale e con i programmi responsivi agli xenobiotici, influenzando le vie di detossificazione dipendenti dall’eme. La disregolazione del flusso di eme guidato da ALAS1 è rilevante per fenotipi di stress metabolico e per meccanismi legati alle porfirie, caratterizzati da un’alterata bilancia degli intermedi porfirinici.

ALAS-H Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (h) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene ALAS1 in human linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus ALAS1, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il ALAS-H Plasmide HDR (h) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito ALAS1.
Se cotrasfettato con il ALAS-H Plasmide CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto ALAS1.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus ALAS1 ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni ALAS1 critici per la funzione ALAS-H
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.