AK4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416951-ACT

AK4 umano codifica l’adenilato chinasi 4, un enzima della matrice mitocondriale che modula l’omeostasi dei nucleotidi adenilici catalizzando reazioni di fosfotransferimento che tamponano i rapporti ATP/ADP/AMP. Modellando l’equilibrio energetico mitocondriale e la segnalazione mediata dai nucleotidi, AK4 influenza la fosforilazione ossidativa, lo stato redox cellulare e i programmi di adattamento allo stress legati all’ipossia e al rimodellamento metabolico. Un’alterata espressione di AK4 è stata associata a cambiamenti nella proliferazione, nella sopravvivenza in condizioni di stress energetico e a fenotipi di disfunzione mitocondriale rilevanti per la biologia del cancro e per altri disturbi in cui la regolazione della bioenergetica è compromessa. In quanto nodo metabolico mitocondriale, AK4 è spesso studiata in vie che collegano il metabolismo dei nucleotidi, la gestione delle specie reattive dell’ossigeno e la segnalazione mitocondriale associata all’apoptosi.

AK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AK4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AK4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AK4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AK4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AK4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AK4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AK4 nelle cellule tumorali con espressione di AK4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.