AK4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416951-ACT

Das humane AK4 kodiert die Adenylatkinase 4, ein Enzym der mitochondrialen Matrix, das die Homöostase von Adeninnukleotiden moduliert, indem es Phosphotransferreaktionen katalysiert, die das ATP/ADP/AMP-Verhältnis puffern. Durch die Beeinflussung der mitochondrialen Energiebilanz und der Nukleotid-Signalgebung wirkt AK4 auf die oxidative Phosphorylierung, den zellulären Redoxzustand sowie stressadaptive Programme im Zusammenhang mit Hypoxie und metabolischem Remodeling. Eine veränderte AK4-Expression wurde mit Änderungen der Proliferation, dem Überleben unter energetischem Stress und Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und andere Erkrankungen relevant sind, bei denen die bioenergetische Regulation gestört ist. Als mitochondrialer metabolischer Knotenpunkt wird AK4 häufig in Signalwegen untersucht, die den Nukleotidstoffwechsel, den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies und apoptoseassoziierte mitochondriale Signalgebung verbinden.

AK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AK4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AK4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AK4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.