AHA-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404964-ACT

AHSA1 kodiert AHA-1, einen HSP90‑Co-Chaperon, der an HSP90 bindet und dessen ATPase-Zyklus beschleunigt, wodurch die effiziente Faltung, Reifung und Stabilität von Client-Proteinen gefördert wird. Durch die Modulation der HSP90‑Chaperon-Maschinerie beeinflusst AHA-1 die Proteostase, Stressantworten sowie den funktionellen Output von Signalproteinen, die an der Zellzykluskontrolle und an Überlebenssignalwegen beteiligt sind. Eine dysregulierte Chaperon-Aktivität und veränderte AHSA1-Expression wurden mit proteotoxischen Stresszuständen und der Umgestaltung onkogener sowie neurodegenerationsassoziierter Protein-Netzwerke in Verbindung gebracht. Daher ist AHSA1 ein nützlicher Knotenpunkt, um die Abhängigkeit von HSP90‑Clients, die zelluläre Anpassung an Stress und die Umverdrahtung von Signalwegen in krankheitsrelevanten Modellsystemen zu untersuchen.

AHA-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AHSA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AHA-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AHSA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AHSA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AHA-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AHSA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AHA-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AHA-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AHSA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.