aggrecan CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400760-ACT

ACAN kodiert Aggrecan, ein großes Chondroitinsulfat-Proteoglykan, das ein zentraler struktureller Bestandteil der extrazellulären Knorpelmatrix ist. Aggrecan interagiert mit Hyaluronan und Link-Protein und bildet hochmolekulare Aggregate, die in Gelenkknorpel einen osmotischen Quellungsdruck und eine hohe Belastungsresilienz vermitteln; dadurch beeinflusst es die Mechanotransduktion der Chondrozyten und die Homöostase der Matrix. Die Expression und der Umsatz von ACAN sind eng mit der Organisation der extrazellulären Matrix, der Biosynthese von Glykosaminoglykanen und dem proteolytischen Remodeling durch Aggrecanasen wie Mitglieder der ADAMTS-Familie gekoppelt. Eine fehlregulierte Aggrecan-Synthese oder eine beschleunigte Spaltung wird mit Knorpeldegeneration und veränderter Skelettentwicklung in Verbindung gebracht, was ACAN zu einem Schlüsselgen für die Untersuchung der Chondrozytenbiologie und des Matrixkatabolismus macht.

aggrecan Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACAN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

aggrecan Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACAN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACAN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen aggrecan-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACAN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von aggrecan-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des aggrecan-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACAN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.