AGAP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409504-ACT

AGAP1 (ArfGAP mit GTPase-Domäne, Ankyrin-Repeat und PH-Domäne 1) ist ein ARF-GTPase-aktivierendes Protein, das Membrantransport und Zytoskelettdynamik koordiniert, indem es die ARF-abhängige Vesikelbildung und den endosomalen Transport reguliert. Über seine PH- und Ankyrin-Repeat-Domänen verknüpft AGAP1 die Phosphoinositid-Signalgebung mit adaptervermittelter Sortierung und beeinflusst dadurch Rezeptorrecycling, Neuritenauswuchs und Aktin-Remodeling. Eine veränderte AGAP1-Expression oder -Funktion wurde mit fehlregulierten endozytotischen Signalwegen und synaptischen Prozessen in Verbindung gebracht, was AGAP1 für Studien zu neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und zur zellulären Homöostase relevant macht. Seine Funktionen an Endosomen und an der Plasmamembran überschneiden sich zudem mit Signalnetzwerken, die von der Verfügbarkeit von Rezeptoren und räumlich begrenzten Phosphoinositid-Pools abhängen.

AGAP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AGAP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AGAP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AGAP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AGAP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AGAP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AGAP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AGAP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AGAP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AGAP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.