Plasmide CRISPR d'Activation (h2) AF-6: sc-404503-ACT-2

Le gène humain AFDN code la protéine d’échafaudage jonctionnelle AF-6 (afadine), un adaptateur multidomaine qui relie les récepteurs d’adhésion de la famille des nectines au cytosquelette d’actine afin d’organiser les jonctions d’adhérence et de maintenir l’intégrité des barrières épithéliale et endothéliale. AF-6 coordonne le remodelage du cytosquelette et la polarité cellulaire en intégrant les signaux de petites GTPases telles que Rap1 et Ras, contribuant à la formation des contacts, à la migration collective et à la mécanotransduction lors de la morphogenèse tissulaire. Une dysrégulation de la fonction et de la localisation d’AFDN/AF-6 a été associée à une altération de l’adhésion cellule–cellule et à un comportement invasif dans le cancer, et des variants affectant la stabilité des jonctions ont été impliqués dans des phénotypes neurodéveloppementaux et vasculaires. AFDN est donc largement utilisé dans les études d’édition génétique et de génomique fonctionnelle pour analyser l’assemblage des jonctions, les réseaux de polarité et les interactions entre voies de signalisation au niveau des contacts cellule–cellule dans des modèles cellulaires humains.

AF-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AFDN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AF-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AFDN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AFDN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AF-6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AFDN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AF-6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AF-6 dans les cellules tumorales présentant une expression de AFDN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.