ADAR2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401166-ACT

Das humane ADARB1 kodiert ADAR2, eine auf RNA wirkende Adenosindeaminase, die in doppelsträngigen RNA-Strukturen eine ortsspezifische A‑zu‑I‑RNA-Editierung katalysiert. Diese posttranskriptionelle Modifikation kann Codons umkodieren, Spleißstellen verändern und die RNA-Stabilität modulieren und prägt dadurch die neuronale Erregbarkeit und synaptische Signalübertragung, indem sie Transkripte mit Bezug zur Neurotransmission editiert. Die ADAR2-Aktivität greift in angeborene, RNA-sensorische Immunwege ein, indem sie die Immunogenität endogener dsRNA verringert und Programme interferon-stimulierter Gene beeinflusst. Fehlregulierte RNA-Editierungsmuster unter Beteiligung von ADAR2 wurden mit neurologischen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht und werden als molekulare Beiträge zu krankheitsassoziiertem Transkriptom-Remodeling untersucht.

ADAR2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADARB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADAR2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADARB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADARB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADAR2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADARB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADAR2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADAR2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADARB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.