ADAMTS-8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405463-ACT

ADAMTS8 kodiert eine sekretierte, zinkabhängige Metalloproteinase aus der ADAMTS-Familie, die die extrazelluläre Matrix (EZM) durch Spaltung von Proteoglykanen und verwandten Substraten umgestaltet. Die Aktivität von ADAMTS-8 trägt zur Regulation der Gewebearchitektur, der Zellmigration und der lokalen Signalübertragung in stromalen und vaskulären Mikroumgebungen bei und verknüpft es damit mit EZM–Rezeptor-Interaktionen und proteasegetriebenem Matrixumbau. Eine dysregulierte Expression wurde in Zusammenhängen von Entzündung, vaskulärem Remodeling und tumorassoziierten Veränderungen der Mikroumgebung beschrieben, bei denen eine veränderte Matrixzusammensetzung angiogene und invasive Phänotypen beeinflussen kann. Entsprechend wird ADAMTS8 häufig als Modulator der extrazellulären Proteolyse und der matrixvermittelten Signalgebung in krankheitsrelevanten Modellen untersucht.

ADAMTS-8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADAMTS8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADAMTS-8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADAMTS8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADAMTS8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADAMTS-8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADAMTS8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADAMTS-8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADAMTS-8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADAMTS8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.