Acid Ceramidase CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419216-ACT

Das Mausgen *Asah1* kodiert die saure Ceramidase, eine lysosomale Hydrolase, die Ceramid durch Deacylierung zu Sphingosin und freien Fettsäuren abbaut und damit das Gleichgewicht zwischen Speicherung und Umsatz von Sphingolipiden mitbestimmt. Durch die Regulation der Ceramid- und Sphingosin-Pools beeinflusst die saure Ceramidase den lysosomenabhängigen Membrantransport, die Autophagie sowie stressresponsive Signalnetzwerke, die mit Zellüberleben und Entzündungsreaktionen verknüpft sind. Eine Störung der ASAH1-Aktivität ist mit einer Akkumulation von Sphingolipiden und lysosomaler Dysfunktion assoziiert und verbindet diesen Signalweg mit neurodegenerativen und systemischen metabolischen Phänotypen. *Asah1* ist daher ein zentraler Knotenpunkt für die Untersuchung ceramidzentrierter Lipidsignale und der lysosomalen Homöostase in zellulären und In-vivo-Mausmodellen.

Acid Ceramidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Asah1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Acid Ceramidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Asah1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Asah1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Acid Ceramidase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Asah1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Acid Ceramidase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Acid Ceramidase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Asah1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.