A33 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404457-ACT

GPA33 kodiert das humane Glykoprotein A33, ein einpassiges transmembranes Zelloberflächenmolekül, das an der epithelialen Differenzierung beteiligt ist und die Aufrechterhaltung der interzellulären Adhäsion unterstützt. A33 ist im Darmepithel angereichert und wird als abstammungslinienassoziierter Marker in Studien zur gastrointestinalen Zellidentität, zum Membrantransport und zur Biologie der epithelialen Barriere verwendet. Seine Expressionsmuster und eine veränderte Regulation werden in der Forschung zu kolorektalen und anderen gastrointestinalen Erkrankungen häufig untersucht, um Veränderungen tumorgebundener epithelialer Programme zu analysieren. GPA33/A33 stellt daher ein gut zugängliches Ziel dar, um die Biologie von Oberflächenantigenen und epitheliale Signalzustände in relevanten Zellmodellen zu untersuchen.

A33 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPA33-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

A33 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPA33-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPA33-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen A33-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPA33-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von A33-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des A33-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPA33-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.