6CKine Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437226-ACT

Il gene murino **Ccl21b** codifica la chemochina **6CKine (CCL21)**, un ligando di **CCR7** che dirige la chemotassi dei linfociti T naïve, dei linfociti T della memoria centrale e delle cellule dendritiche mature verso l’endotelio linfatico e le zone T negli organi linfoidi secondari. Stabilendo gradienti lungo i vasi linfatici e all’interno dei linfonodi, 6CKine sostiene il traffico delle cellule immunitarie, la sorveglianza dell’antigene e l’organizzazione dei microambienti linfoidi. La segnalazione **CCL21–CCR7** interagisce con vie mediate da **GPCR** che regolano il rimodellamento dell’actina, l’attivazione delle integrine e la migrazione direzionale, influenzando il posizionamento dei leucociti e il dialogo tra stroma e sistema immunitario. Un’attività deregolata dell’asse **CCL21/CCR7** è stata associata ad alterato reclutamento di cellule infiammatorie, a rimodellamento immunitario legato alla linfangiogenesi e a cambiamenti del microambiente osservati in contesti immuno-mediati e neoplastici.

6CKine Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ccl21b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

6CKine Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ccl21b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ccl21b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 6CKine. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ccl21b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 6CKine nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 6CKine nelle cellule tumorali con espressione di Ccl21b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.