6CKine Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403041-ACT

Il gene umano CCL21 codifica la chemochina 6CKine, un ligando omeostatico di CCR7 che guida le cellule dendritiche e i linfociti T naïve verso gli organi linfoidi secondari e supporta l’organizzazione del tessuto linfoide. Stabilendo gradienti chemiotattici, CCL21 regola il traffico dei leucociti, il dialogo tra endotelio linfatico e cellule immunitarie e il posizionamento delle cellule presentanti l’antigene durante la sorveglianza immunitaria. Questo asse si integra con la segnalazione dei GPCR, il rimodellamento del citoscheletro e i programmi di adesione che determinano la migrazione e la compartimentalizzazione cellulare. Una segnalazione CCL21/CCR7 disregolata è stata associata a un reclutamento alterato di cellule infiammatorie e al rimodellamento del microambiente immunitario in condizioni quali l’infiammazione cronica e la linfangiogenesi associata ai tumori, rendendolo un bersaglio utile per studi di immunologia meccanicistica.

6CKine Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCL21 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

6CKine Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCL21 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCL21, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 6CKine. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCL21 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 6CKine nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 6CKine nelle cellule tumorali con espressione di CCL21 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.