3632451O06Rik CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426549-ACT

Mouse 3632451O06Rik kodiert ein weitgehend uncharakterisiertes Protein mit nur begrenzter funktioneller Annotation und ist damit ein nützliches Ziel für die Kartierung genregulatorischer Netzwerke und kontextabhängiger zellulärer Phänotypen. Neue Evidenz auf Transkriptebene deutet darauf hin, dass 3632451O06Rik an Prozessen der Zellzustandskontrolle wie Proliferation, Stressanpassung und Differenzierung beteiligt sein könnte, bei denen bereits moderate Expressionsänderungen den Output von Signalwegen beeinflussen können. Da das Gen in kuratierten Signalwegkarten bislang kaum verankert ist, sind kontrollierte Perturbationen wertvoll, um die Expression von 3632451O06Rik mit nachgeschalteten Transkriptionsprogrammen und Protein-Interaktionsmodulen zu verknüpfen. Solche Studien können krankheitsrelevante Biologie unterstützen, indem sie Assoziationen mit aberranten Genexpressionssignaturen aufzeigen, die in Kontexten von Entzündung, Neurobiologie und Krebsmodellen beobachtet werden, ohne dabei einen klinischen Nutzen zu implizieren.

3632451O06Rik Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen 3632451O06Rik-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

3632451O06Rik Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des 3632451O06Rik-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der 3632451O06Rik-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 3632451O06Rik-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native 3632451O06Rik-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 3632451O06Rik-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 3632451O06Rik-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem 3632451O06Rik-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.