20S Proteasome β3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409667-ACT

PSMB3 kodiert die humane 20S-Proteasom-β3-Untereinheit des katalytischen Kerns, eine strukturelle Komponente des 26S-Proteasoms, die den ATP-abhängigen Abbau ubiquitinierter Proteine ermöglicht. Die proteasomvermittelte Proteolyse reguliert die Proteinqualitätskontrolle, die Antigenprozessierung und den Zellzyklusfortschritt und greift in Signalwege ein, die Stressantworten, DNA-Schadenssignalisierung und die NF-κB-Aktivität steuern. Störungen der Expression von Proteasom-Untereinheiten können die Proteostase neu ausrichten und den Abbau kurzlebiger regulatorischer Proteine verändern, wodurch Apoptose, Proliferation und Immun-Signalgebung beeinflusst werden. Eine fehlregulierte Proteasomfunktion und eine veränderte Untereinheitenzusammensetzung wurden über weitreichende Effekte auf die Protein-Homöostase mit Krebsbiologie, Neurodegeneration und entzündlicher Pathophysiologie in Verbindung gebracht.

20S Proteasome β3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PSMB3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

20S Proteasome β3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PSMB3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PSMB3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 20S Proteasome β3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PSMB3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 20S Proteasome β3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 20S Proteasome β3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PSMB3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.