14-3-3 η CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423749-ACT

Maus-Ywhah kodiert das Adapterprotein 14-3-3η, ein Mitglied der 14-3-3-Familie, das Phosphoserin-/Phosphothreonin-Motive erkennt und so die Lokalisation, Stabilität und Aktivität unterschiedlichster Signalproteine reguliert. Durch die Bindung an Kinasen, Phosphatasen und Transkriptionsregulatoren ist 14-3-3η an der phosphorylierungsabhängigen Kontrolle der Zellzyklusprogression, von Stressantworten und Apoptose beteiligt und integriert Signale nachgeschalteter Signalwege wie MAPK und PI3K/AKT. Im Nerven- und Immunsystem helfen 14-3-3-Proteine, synaptische Funktion, Zytoskelettdynamik und inflammatorische Signalgebung zu koordinieren, wodurch Ywhah einen nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Proteostase und Signaltransduktion in Mausmodellen darstellt. Eine Fehlregulation 14-3-3‑vermittelter Interaktionen wurde mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, onkogene Signalgebung und Autoimmunität relevant sind, was seinen Einsatz in der signalwegfokussierten krankheitsbiologischen Forschung unterstützt.

14-3-3 η Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ywhah-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

14-3-3 η Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ywhah-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ywhah-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 14-3-3 η-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ywhah-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 14-3-3 η-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 14-3-3 η-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ywhah-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.