14-3-3 η CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402892-ACT

YWHAH kodiert das humane Adapterprotein 14-3-3 eta (η), ein Mitglied der 14-3-3-Familie, das an Phosphoserin-/Phosphothreonin-Motive bindet und dadurch Proteinlokalisation, -stabilität und den Aufbau von Signalkomplexen moduliert. Über Interaktionen mit verschiedenen Kinasen, Phosphatasen und transkriptionellen Regulatoren ist 14-3-3η an der phosphorylierungsabhängigen Kontrolle der Zellzyklusprogression, von Stressantworten und der Apoptose beteiligt und verknüpft Signalwege wie MAPK/ERK, PI3K–AKT und RAF. Eine veränderte YWHAH-Aktivität wurde in Zusammenhängen dysregulierter Proliferation und des Überlebens untersucht, einschließlich neurobiologischer Phänotypen und einer krebsassoziierten Umprogrammierung von Signalwegen. Als Gerüstprotein, das multiple Signaleingänge integriert, wird 14-3-3η häufig hinsichtlich seines Einflusses auf Proteostase, Zytoskelettdynamik und kontextabhängige Transkriptionsprogramme untersucht.

14-3-3 η Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen YWHAH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

14-3-3 η Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des YWHAH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der YWHAH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 14-3-3 η-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native YWHAH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 14-3-3 η-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 14-3-3 η-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem YWHAH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.