γ Enolase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400763-ACT

ENO2 kodiert die humane γ-Enolase (neuronen-spezifische Enolase), ein glykolytisches Metalloenzym, das die Umwandlung von 2-Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat katalysiert und damit die ATP-Produktion sowie den metabolischen Stofffluss unterstützt. Über seine metabolische Funktion hinaus ist γ-Enolase in Neuronen und neuroendokrinen Zellen angereichert und mit zellulären Stressantworten, Differenzierungsprogrammen und der Aufrechterhaltung der neuronalen Integrität verknüpft. Die ENO2-Expression wird häufig genutzt, um neuroendokrine Linienstadien, metabolische Reprogrammierung und veränderte Glykolyse in krankheitsassoziierten Kontexten zu untersuchen, darunter neurologische Erkrankungen und Tumorbiologie. Als Knotenpunkt im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel bietet ENO2 einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um zu untersuchen, wie die Kontrolle der Glykolyse mit Redox-Gleichgewicht und Zellzustandsregulation zusammenwirkt.

γ Enolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ENO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

γ Enolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ENO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ENO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen γ Enolase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ENO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von γ Enolase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des γ Enolase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ENO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.