γC-crystallin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402940-ACT

CRYGC kodiert das humane γC‑Kristallin, ein in hoher Menge vorkommendes Strukturprotein der Augenlinse, das durch stabile, dicht gepackte Proteinanordnungen zum Brechungsindex und zur langfristigen Transparenz beiträgt. Als Mitglied der β/γ‑Kristallin‑Superfamilie unterstützt γC‑Kristallin die Architektur der Linsenfaserzellen und die Proteostase unter Bedingungen mit minimalem Proteinumsatz. Eine Störung der Kristallin‑Homöostase kann Proteinfehlfaltung und Aggregation begünstigen und verbindet eine Dysregulation von CRYGC mit Linsentrübungs‑Phänotypen. CRYGC wird daher häufig als Marker und mechanistischer Ansatzpunkt genutzt, um Linsenentwicklung, Stressantworten und Proteinaggregationsprozesse zu untersuchen, die für die Kataraktbiologie relevant sind.

γC-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRYGC-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

γC-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRYGC-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRYGC-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen γC-crystallin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRYGC-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von γC-crystallin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des γC-crystallin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRYGC-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.