γB-crystallin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402939-ACT

CRYGB kodiert das humane γB‑Crystallin, ein sehr häufig vorkommendes, langlebiges Strukturprotein der Augenlinse, das durch dichte, zugleich aber lösliche Proteinpackung zum Brechungsindex und zur optischen Transparenz beiträgt. Als Mitglied der β/γ‑Crystallin-Superfamilie unterstützt γB‑Crystallin die Homöostase der Linsenfaserzellen, indem es die Proteinstabilität aufrechterhält und unter oxidativem sowie osmotischem Stress Aggregation entgegenwirkt. Eine Störung der Crystallin-Proteostase steht mit lichtstreuenden Aggregaten und Linsentrübung in Zusammenhang, und CRYGB‑Varianten wurden mit erblichen Katarakt‑Phänotypen assoziiert. Daher wird CRYGB häufig eingesetzt, um Linsenentwicklung, Proteinfaltung/-aggregation und stressresponsive Signalwege zu untersuchen, die die Transparenz beeinflussen.

γB-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRYGB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

γB-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRYGB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRYGB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen γB-crystallin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRYGB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von γB-crystallin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des γB-crystallin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRYGB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.