Plásmido CRISPR de Activación (h) γB-crystallin: sc-402939-ACT

CRYGB codifica la γB-cristalina humana, una proteína estructural del cristalino altamente abundante y de larga vida media, que contribuye al índice de refracción y a la transparencia óptica mediante un empaquetamiento proteico denso pero soluble. Como miembro de la superfamilia de las β/γ-cristalinas, la γB-cristalina favorece la homeostasis de las células de las fibras del cristalino al mantener la estabilidad proteica y resistir la agregación en condiciones de estrés oxidativo y osmótico. La alteración de la proteostasis de las cristalinas se asocia con agregados que dispersan la luz y con la opacificación del cristalino, y se han vinculado variantes de CRYGB con fenotipos de catarata hereditaria. En consecuencia, CRYGB se utiliza ampliamente para estudiar el desarrollo del cristalino, el plegamiento/agregación de proteínas y las vías de respuesta al estrés que influyen en la transparencia.

γB-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRYGB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

γB-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRYGB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRYGB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de γB-crystallin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRYGB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de γB-crystallin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía γB-crystallin en células tumorales con expresión de CRYGB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.