γ1-Adaptin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403986-ACT

AP1G1 kodiert die menschliche γ1‑Adaptin‑Untereinheit des Adaptorprotein-Komplexes 1 (AP‑1), einer zentralen Mantelkomponente, die Fracht auswählt und die clathrinvermittelte Vesikelbildung am trans-Golgi-Netzwerk und an Endosomen antreibt. Durch die Erkennung von Sortierungsmotiven auf Transmembranproteinen trägt γ1‑Adaptin zur Koordination des Rezeptor-Recyclings, der lysosomalen Zielsteuerung und des polarisierten Membrantransports bei und beeinflusst damit die Signaldauer und die Membranzusammensetzung. Der AP‑1‑abhängige Transport ist mit der endosomalen Reifung sowie Autophagie‑Lysosom‑Signalwegen verknüpft und unterstützt so die Proteostase und die regulierte Sekretion. Veränderungen der Funktion von Adaptor-Komplexen und der Dynamik des Vesikeltransports sind in der Forschung zu neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen, zum Rezeptortransport in Immunzellen und zu fehlregulierter Wachstumsfaktor-Signalgebung relevant, wie sie in verschiedenen Krankheitskontexten beobachtet wird.

γ1-Adaptin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AP1G1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

γ1-Adaptin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AP1G1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AP1G1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen γ1-Adaptin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AP1G1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von γ1-Adaptin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des γ1-Adaptin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AP1G1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.