βENaC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401371-ACT

SCNN1B kodiert die β‑Untereinheit des epithelialen Natriumkanals (βENaC), eine zentrale Komponente des amiloridempfindlichen Na⁺‑Transports über apikale Membranen in epithelialen Geweben. Zusammen mit den α‑ und γ‑Untereinheiten unterstützt βENaC die Natriumrückresorption und die Flüssigkeitshomöostase und verknüpft damit den Ionentransport mit der epithelialen Barrierefunktion sowie Signalwegen der Volumenregulation. Die ENaC‑Aktivität ist in proteolytische Prozessierung, ubiquitinabhängiges Trafficking (einschließlich NEDD4L‑vermittelter Regulation) und hormonabhängige Signalübertragung eingebettet, die Kanalmenge und Öffnungswahrscheinlichkeit fein abstimmt. Eine veränderte Expression oder Funktion von SCNN1B wurde mit Störungen der Salzhandhabung und der Regulation der Flüssigkeitsschicht auf der Atemwegsoberfläche in Verbindung gebracht und ist daher relevant für Untersuchungen der Epithelphysiologie und krankheitsassoziierter Phänotypen des Ionentransports.

βENaC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SCNN1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

βENaC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SCNN1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SCNN1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen βENaC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SCNN1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von βENaC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des βENaC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SCNN1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.