β1-Adaptin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402948-ACT

AP1B1 kodiert β1-Adaptin, eine zentrale Untereinheit des Adaptorkomplexes 1 (AP-1), der die Frachterkennung mit der clathrinvermittelten Vesikelbildung am trans-Golgi-Netzwerk und an Endosomen koppelt. Durch die Bindung an Sortierungsmotive in Transmembranproteinen koordiniert AP-1 den polarisierten Transport, das endosomale Recycling und die Aufrechterhaltung der Membranzusammensetzung in Epithel- und Nervenzellen. Eine Störung des AP-1-abhängigen Transports beeinträchtigt die Rezeptor-Lokalisierung und die resultierenden Signaloutputs und verknüpft eine AP1B1-Fehlfunktion mit Defekten der Zellpolarität, neuroentwicklungsbezogenen Prozessen und der Homöostase von Membranproteinen. Als zentraler Knotenpunkt des intrazellulären Transports wird β1-Adaptin häufig im Kontext der Endosom–Golgi-Dynamik, der Genauigkeit der Frachtsortierung und der Kommunikation zwischen Organellen untersucht.

β1-Adaptin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AP1B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β1-Adaptin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AP1B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AP1B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β1-Adaptin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AP1B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β1-Adaptin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β1-Adaptin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AP1B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.