Plásmido CRISPR de Activación (m) α_1A-AR: sc-419021-ACT

El gen Adra1a de ratón codifica el receptor adrenérgico alfa1A (α1A-AR), un receptor acoplado a proteína G que se acopla predominantemente a Gq/11 para activar la fosfolipasa C, incrementar la señalización de IP3/DAG, movilizar Ca2+ intracelular y estimular respuestas dependientes de PKC. La señalización del α1A-AR modula el tono del músculo liso, la resistencia vascular y la regulación simpática en tejidos cardiovasculares y urogenitales, y también influye en la excitabilidad neuronal y la señalización sináptica en el sistema nervioso central. La activación de las vías downstream se intersecta con la señalización MAPK/ERK y con programas transcripcionales que controlan la contracción, el metabolismo y las respuestas al estrés. La actividad desregulada de los receptores adrenérgicos y la alteración de su expresión se han implicado en modelos de hipertensión, disfunción del tracto urinario inferior y fenotipos neuroconductuales, lo que respalda a Adra1a como una diana para estudios mecanísticos de redes de señalización simpática.

α1A-AR El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Adra1a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

α1A-AR El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Adra1a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Adra1a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de α1A-AR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Adra1a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de α1A-AR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía α1A-AR en células tumorales con expresión de Adra1a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.