α-KGD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402915-ACT

OGDH kodiert die E1‑Komponente des mitochondrialen 2‑Oxoglutarat‑Dehydrogenase‑Komplexes (α‑KGD), eines geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms im Tricarbonsäurezyklus (TCA‑Zyklus), das α‑Ketoglutarat in Succinyl‑CoA umwandelt und dabei NADH für die oxidative Phosphorylierung erzeugt. Über die Kontrolle des α‑Ketoglutarat‑Flusses verknüpft OGDH den zentralen Kohlenstoffstoffwechsel mit dem Aminosäureabbau, dem Redoxgleichgewicht und dem Umgang der Mitochondrien mit reaktiven Sauerstoffspezies. Veränderungen der OGDH‑Aktivität können die Spiegel von α‑Ketoglutarat und verwandten Metaboliten verändern, die über Dioxygenasen die epigenetische Regulation beeinflussen, und so den mitochondrialen Stoffwechsel mit dem Chromatinzustand koppeln. Eine Fehlregulation dieses Knotens wurde mit mitochondrialen Stoffwechselstörungen in Verbindung gebracht und u. a. im Kontext von Neurodegeneration und Tumormetabolismus untersucht.

α-KGD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OGDH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

α-KGD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OGDH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OGDH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen α-KGD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OGDH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von α-KGD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des α-KGD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OGDH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.