αA-crystallin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402047-ACT

CRYAA kodiert das humane αA‑Crystallin, ein kleines Hitzeschockprotein, das als ATP‑unabhängiges molekulares Chaperon wirkt und die Proteostase aufrechterhält, indem es die Aggregation teilweise entfalteter Proteine verhindert. αA‑Crystallin wird stark in der Augenlinse exprimiert und trägt zudem über Interaktionen mit Client‑Proteinen und anderen Chaperonnetzwerken zur Organisation des Zytoskeletts, zur Stresstoleranz und zur Regulation der Apoptose bei. Die Aktivität von CRYAA ist mit zellulären Antworten auf oxidativen Stress und mit Signalwegen der Proteinkontrolle verknüpft, die für die Aufrechterhaltung der Linsentransparenz entscheidend sind. Eine Fehlregulation oder Mutation von CRYAA ist mit Proteinaggregations‑Phänotypen assoziiert und wurde mit der molekularen Pathologie der Katarakt sowie allgemeiner mit der Biologie von Stressantworten in Verbindung gebracht.

αA-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRYAA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

αA-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRYAA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRYAA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen αA-crystallin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRYAA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von αA-crystallin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des αA-crystallin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRYAA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.