XPA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401483-ACT

O XPA humano codifica um fator central de reconhecimento de danos ao DNA na via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER), que verifica lesões que distorcem a dupla hélice e coordena o recrutamento de TFIIH, RPA e ERCC1–XPF para viabilizar a dupla incisão e a síntese de reparo. Ao atuar como plataforma para complexos de reparo em fotoprodutos induzidos por UV e adutos químicos volumosos, o XPA ajuda a preservar a integridade do genoma durante a replicação e a transcrição. A interrupção ou a atividade reduzida de XPA compromete a capacidade de NER, aumentando a carga mutacional e a sensibilidade celular ao estresse genotóxico. A disfunção de XPA está associada ao xeroderma pigmentoso do grupo A e é frequentemente explorada em estudos de deficiência de reparo de DNA, mutagênese e sinalização de resposta ao estresse.

XPA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de XPA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

XPA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus XPA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição XPA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de XPA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus XPA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de XPA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via XPA em células tumorais com expressão de XPA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.