Wnt-5b Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-402157-ACT-2

Il gene umano WNT5B codifica il ligando secreto Wnt-5b, un mediatore chiave della segnalazione Wnt indipendente da β-catenina (non canonica), che regola la polarità cellulare, la migrazione direzionale e il rimodellamento del citoscheletro attraverso vie quali la polarità planare delle cellule e la segnalazione Wnt/Ca²⁺. Wnt-5b interagisce con i recettori Frizzled e con co-recettori (inclusi i membri della famiglia ROR) per modulare gli effettori a valle che contribuiscono alla morfogenesi dei tessuti, alla differenziazione mesenchimale e al cross-talk con la segnalazione infiammatoria. Un’alterata espressione o segnalazione di WNT5B è stata associata a programmi di sviluppo deregolati ed è spesso oggetto di studio in contesti quali l’invasività delle cellule tumorali, la regolazione metabolica e adipogenica e il rimodellamento fibrotico. L’editing genetico di WNT5B supporta studi meccanicistici sull’architettura specifica dei ligandi nelle reti Wnt, sull’utilizzo dei recettori e sugli esiti trascrizionali e fenotipici in modelli cellulari ingegnerizzati e in sistemi di organoidi.

Wnt-5b Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-5b Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-5b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-5b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-5b nelle cellule tumorali con espressione di WNT5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.