Plásmido CRISPR de Activación (m) Wee 1: sc-423702-ACT

Wee1 codifica la proteína quinasa WEE1, un regulador conservado del punto de control de daño en el ADN en G2/M que frena la entrada en mitosis mediante la fosforilación inhibitoria de CDK1, coordinando la finalización de la fase S, las respuestas al estrés de replicación y la integridad del genoma. En células de ratón, WEE1 integra señales de ATR/CHK1 y de otras vías de control para modular el ritmo del ciclo celular, estabilizar horquillas de replicación detenidas y limitar la acumulación de roturas de doble cadena del ADN. La alteración de la actividad de Wee1 modifica la proliferación, la estabilidad cromosómica y los programas de apoptosis, por lo que se utiliza ampliamente como nodo para estudiar el estrés de replicación, la adaptación del punto de control y fenotipos tipo catástrofe mitótica. La señalización desregulada de WEE1 se examina con frecuencia en el contexto de la aceleración del ciclo celular impulsada por oncogenes y de las dependencias de vías de reparación del ADN, lo que respalda la investigación mecanística en biología del cáncer y mantenimiento del genoma.

Wee 1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Wee1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Wee 1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Wee1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Wee1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Wee 1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Wee1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Wee 1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Wee 1 en células tumorales con expresión de Wee1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.