VSTM3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404147-ACT

O TIGIT, também conhecido como VSTM3, codifica um imunorreceptor inibitório expresso em células T ativadas, células T reguladoras e células NK, que ajuda a manter a homeostase imunológica. Ao se ligar a ligantes da família do receptor do poliovírus, como PVR (CD155) e PVRL2 (CD112), o TIGIT modula a sinalização do tipo ITIM e contrabalança vias coestimuladoras, moldando a citotoxicidade, a produção de citocinas e a função da sinapse imunológica. Alterações na sinalização do TIGIT estão implicadas na evasão imunológica e na disfunção da imunidade antitumoral, bem como em contextos de inflamação crônica e autoimunidade, tornando-o um nó central na biologia de checkpoints imunológicos. Como receptor de superfície que integra sinais de adesão e inibição, o TIGIT oferece um ponto de entrada mecanístico para estudar interações receptor–ligante, programas transcricionais de linfócitos exaustos e a comunicação cruzada com a sinalização de CD226/DNAM-1.

VSTM3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TIGIT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VSTM3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TIGIT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TIGIT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VSTM3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TIGIT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VSTM3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VSTM3 em células tumorais com expressão de TIGIT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.