VPS28 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404226-ACT

O VPS28 humano codifica uma subunidade central do complexo ESCRT-I, que coordena a triagem endossomal de proteínas de membrana ubiquitinadas e promove a biogênese de corpos multivesiculares no trajeto para a degradação lisossomal. Por meio da atividade da via ESCRT, o VPS28 ajuda a regular a redução de receptores na superfície celular, a remodelação de membranas e eventos de tráfego que influenciam a atenuação de sinais e a proteostase. A função do ESCRT-I também se relaciona com a abscisão na citocinese e com processos de brotamento viral que exploram a maquinaria do hospedeiro para cisão de membranas. A desregulação do tráfego endolisossomal e de componentes do ESCRT está associada a alterações na sinalização por fatores de crescimento e a fenótipos de estresse celular relevantes para pesquisas em câncer e neurodegeneração.

VPS28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS28 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS28 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS28, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS28. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS28 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS28 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS28 em células tumorais com expressão de VPS28 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.