Plasmide CRISPR d'Activation (h) VMAT 2: sc-401308-ACT

SLC18A2 code le transporteur vésiculaire des monoamines 2 (VMAT2), un antiporteur à protons qui charge, depuis le cytosol, la dopamine, la sérotonine, la noradrénaline, l’adrénaline et l’histamine dans des vésicules de sécrétion en couplant le transport au gradient électrochimique de H+ vésiculaire. Cette étape de chargement vésiculaire est au cœur du stockage et de la libération régulés des neurotransmetteurs, influence l’intensité de la signalisation synaptique et limite l’accumulation cytosolique de monoamines pouvant favoriser le stress oxydatif. La fonction de VMAT2 s’intègre aux voies de biogenèse et de trafic des vésicules et est étroitement liée à l’homéostasie présynaptique dans les neurones monoaminergiques et les cellules neuroendocrines. Une expression modifiée de SLC18A2 ou une activité altérée de VMAT2 a été associée à une vulnérabilité du système dopaminergique et a été étudiée dans le contexte de la maladie de Parkinson, des troubles de l’humeur et des neuroadaptations liées à l’usage de substances.

VMAT 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC18A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VMAT 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC18A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC18A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VMAT 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC18A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VMAT 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VMAT 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC18A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.