V-ATPase D Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403291-ACT

ATP6V1D codifica a subunidade D do domínio V1 da H+-ATPase vacuolar (V-ATPase), uma ATPase rotatória que acopla a hidrólise de ATP ao bombeamento de prótons através de membranas intracelulares. Ao sustentar a acidificação de organelos, a subunidade D da V-ATPase contribui para a maturação endossomo–lisossomo, o fluxo autofágico, a reciclagem de recetores e o tráfego dependente de pH ao longo das vias secretora e endocítica. O controlo de pH dependente da V-ATPase também influencia a deteção de nutrientes, incluindo a sinalização do mTORC1 na superfície lisossomal, e molda a atividade de proteases em compartimentos ácidos. A desregulação da função da V-ATPase e da acidificação vesicular tem sido associada a alterações da proteostase, a processos neurodegenerativos e a fenótipos metabólicos e invasivos ligados ao cancro, tornando o ATP6V1D um nó útil para estudos mecanísticos da homeostase celular.

V-ATPase D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP6V1D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

V-ATPase D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP6V1D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP6V1D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de V-ATPase D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP6V1D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de V-ATPase D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via V-ATPase D em células tumorais com expressão de ATP6V1D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.