Plasmide CRISPR d'Activation (h) USP9X: sc-402285-ACT

USP9X (ubiquitin specific peptidase 9 liée au chromosome X) est une enzyme déubiquitinante qui régule la stabilité des protéines et l’intensité des signaux de signalisation en retirant des chaînes d’ubiquitine des protéines substrats. Elle influence la protéostasie, le trafic endocytique et les voies de réponse au stress, et a été associée à la modulation de l’apoptose, au contrôle du cycle cellulaire et aux réponses aux dommages de l’ADN, via une stabilisation dépendante du contexte de composants clés de la signalisation. L’activité d’USP9X s’inscrit à l’interface des réseaux ubiquitine–protéasome et d’autophagie, orientant les décisions cellulaires de différenciation et de survie. Une expression ou une fonction dérégulée d’USP9X a été associée à plusieurs cancers et à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la signalisation par l’ubiquitine dans les cellules humaines.

USP9X Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de USP9X sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

USP9X Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus USP9X dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription USP9X, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de USP9X. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus USP9X natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de USP9X au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie USP9X dans les cellules tumorales présentant une expression de USP9X silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.