URB Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408597-ACT

CCDC80 codifica a URB, uma proteína associada à matriz extracelular e secretada, implicada na remodelação do estroma, na adesão célula–matriz e na regulação da sinalização de fatores de crescimento. A URB tem sido associada a vias que influenciam a adipogênese, a homeostase metabólica e o controle, dependente do contexto, da proliferação e migração celulares, em consonância com um papel na organização tecidual e na comunicação cruzada mesenquimal–epitelial. Alterações na expressão de CCDC80 foram relatadas em múltiplos contextos de doença, incluindo fenótipos relacionados à obesidade e cânceres, nos quais podem correlacionar-se com mudanças na composição do microambiente tumoral e no comportamento invasivo. Essas características tornam o CCDC80 um alvo útil para dissecar redes de sinalização extracelular, biologia da matriz e programas transcricionais associados a mudanças de estado fenotípico.

URB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCDC80 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

URB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCDC80 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCDC80, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de URB. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCDC80 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de URB no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via URB em células tumorais com expressão de CCDC80 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.